Закрыть
Авторизация
Логин:
Пароль:

Забыли пароль?
Регистрация
Горячая линия (24 часа)
+7(923)590-13-23

667003 Республика Тыва, г. Кызыл, ул.Чехова, д.65

+7(39422)-6-38-47

email: infeksiatuva@mail.ru


Версия сайта для слабовидящих

Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Республики Тыва «Инфекционная больница»

(ГБУЗ РТ "Инфекционная больница")

ПЦР-диагностика

МЕТОД ПЦР-ДИАГНОСТИКИ

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

ПЦР - метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя.

ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем (ИППП).

Также, этим методом проводят диагностику вирусных инфекций, таких как гепатиты, ВИЧ и др. Чувствительность метода значительно превосходит таковую у иммунохомических и микробиологических методов, а принцип метода позволяет диагностировать наличие инфекций со значительной антигенной изменчивостью.

Специфичность ПЦР при использовании технологии PCR даже для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.

Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т. д.). В урологической и гинекологической практике - для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллёза, микоплазменной инфекции, ВПЧ - вирусов папилломы человека; в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулёза; в гастроэнтерологии - для выявления хеликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний - в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллёза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии - для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов.

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами - короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18 - 30 букв. Каждый из праймеров сопоставим (комплементарен) с одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

После соединения (гибридизации) матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.

ПЦР-исследования выполняют на амплификаторе CFX-96 Touch – это многофункциональный высокоскоростной Real Time амплификатор, позволяющий проводить мультиплексный анализ до 5 мишеней в 96 пробах одновременно. Амплификатор CFX-96 создан на основе амплификатора С1000 Touch и шестиканального оптического реакционного модуля CFX-96.

CFX96

 

Выявляемый микроорганизм 

Вид биологического материала

ДНК Бордетелла пертуссис (Bordetella pertussis) 

Мазки с задней стенки глотки

ДНК Вируса Эпштейна-Барр (EBV)

Слюна, моча, соскобы из уретры, цервикального канала, заднего свода влагалища, мононуклеарная фракция клеток периферической крови

ДНК Цитомегаловируса (CMV)

Слюна, моча, соскобы из уретры, цервикального канала, заднего свода влагалища, мононуклеарная фракция клеток периферической крови

РНК Энтеровирусов (Enterovirus) 

Спинномозговая жидкость(ликвор), фекалии

РНК Вирусного гепатита А (HAV) качественное исследование 

Периферическая кровь (плазма крови)

ДНК Вирусного гепатита В (HBV) качественное и количественное исследование 

Периферическая кровь (плазма крови)

РНК Вирусного гепатита С (HCV) качественное и количественное исследование 

Периферическая кровь (плазма крови)

РНК Вирусного гепатита С (HCV)

Генотипирование вируса гепатита 1, 2 и 3

Периферическая кровь (плазма крови)

РНК Вирусного гепатита D (HDV) Качественное исследование

Периферическая кровь (плазма крови)

РНК Вирусов гриппа А (Influenza А virus) Качественное исследование 

Мазки и смывы из полости носа и ротоглотки, мокрота

РНК Вирусов гриппа В (Influenza В virus) Качественное исследование

Мазки и смывы из полости носа и ротоглотки, мокрота

РНК Вирусов гриппа А «свиной грипп» - Пан H1N1 (Influenza А virus (H1N1) Качественное исследование

Мазки и смывы из полости носа и ротоглотки, мокрота

РНК Вирусов гриппа А «птичий грипп» субтипа H5N1 (Influenza А virus (subtypeH5N1) Качественное исследование

Мазки и смывы из полости носа и ротоглотки, мокрота

РНК коронавирусов

Мазки со слизистой нижнего носового хода, мазки из ротоглотки, мокрота или аспират из трахеи, плазма крови, фекалии.

ДНК парвовирусов В 19

Смывы и мазки из ротоглотки, слюна, плазма крови

 

Для получения корректных результатов большое значение имеет качество образца биоматериала для исследования, его хранение, транспортировка и предварительная обработка.

Исследование методом ПЦР относится к прямым методам лабораторного исследования, поэтому взятие биологического материала необходимо проводить из места локализации инфекционного процесса.

  1. Взятие образцов периферической крови. Взятие крови проводится в пластиковые пробирки объемом 2,5 мл с добавлением в качестве антикоагулянта динатриевой солью этилендиаминтетраацетата (сиреневые крышки – 6% ЭДТА) в конечной концентрации 2,0 мг/мл. Для перемешивания с антикоагулянтом пробирку переворачивают 2 – 3 раза. Время взятия материала до получения плазмы не должно превышать 6 часов.
  2. Особенности взятия мазков из полости носа. Зонд вводят легким движением по наружной стенки носа на глубину 2 – 3 см до нижней раковины. Затем зонд слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа. Перенесите зонд с биоматериалом в пробирку с транспортной средой и тщательно прополощите его, избегая разбрызгивания жидкости. Затем извлеките зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки, отожмите избыток жидкости и выбросьте. Время взятия материала до начала исследования не должно превышать 24 часов.
  3. Особенности взятия мазков из ротоглотки. Мазки берут вращательным движением с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки глотки. Перенесите зонд с биоматериалом в пробирку с транспортной средой и тщательно прополощите его, избегая разбрызгивания жидкости. Затем извлеките зонд из раствора, прижимая его к стенке пробирки, отожмите избыток жидкости и выбросьте. Время взятия материала до начала исследования не должно превышать 24 часов.
  4. Особенности взятия смывов из ротоглотки. Перед взятием смывов из ротоглотки проводят предварительное полоскание полости рта водой. После этого проводят тщательное полоскание ротоглотки (в течение 10 – 15 секунд) 8,0 – 10 мл стерильного физиологического раствора. Жидкость собирают через воронку в стерильную пробирку. Не допускается повторное использование воронки без предварительного автоклавирования. Время взятия материала до начала исследования не должно превышать 24 часов.
  5. Особенности взятия смывов из полости носа. Взятие материала производят в положении больного сидя с отклоненной назад головой. Для получения смыва из полости носа в оба носовых хода поочередно с помощью зонда или одноразового шприца вводят по 3,0 – 5,0 мл теплого стерильного физиологического раствора. Промывную жидкость из обоих носовых ходов собирают через воронку в одну стерильную пробирку. Не допускается повторное использование воронки без предварительного автоклавирования. Время взятия материала до начала исследования не должно превышать 24 часов.
  6. Мокрота или аспират из трахеи. Мокроту собирают в стерильные герметичные одноразовые пластиковые контейнеры после предварительного полоскания полости рта водой. Аспираты из трахеи получают традиционным способом и помещают в стерильные герметичные одноразовые пластиковые контейнеры.
  7. Фекалии. Образцы забирают в стерильный горшок или подкладное судно. Затем в количестве 1 г (примерно) переносят в одноразовую герметичную емкость из полипропилена.
  8. Слюна. Слюну собирают в стерильную пробирку типа «Эппендорф» объемом 1,5 мл в количестве 0,2-1,0 мл после трехкратного полоскания рта кипяченной водой.

 

Интерпретация результатов количественного определения ДНК вируса гепатита Б (HBV) и РНК вируса гепатита С (HCV) методом ПЦР:

·         если значение вирусной нагрузки находится в пределах 7,5 х 102 – 1,0 х 108 копий/мл, результат определяется как положительный с указанием вирусной нагрузки в образце (копий/мл.)

·         если значение вирусной нагрузки выходит за рамки линейного диапазона, то для образцов с низкой вирусной нагрузкой (значение, определенное программой меньше 7,5 х 102 копий/мл) результат фиксируется как «менее 7,5 х 102 копий/мл». Для образцов с высокой вирусной нагрузкой (значение, определенное программой, больше 1,0 х 108 копий/мл) результат фиксируется как: «более 1,0 х 108 копий/мл»

 

Интерпретация результатов качественнного определения ДНК вируса гепатита Б (HBV) и РНК вируса гепатита С (HCV) методом ПЦР: обнаружена РНК HCV/ ДНК HBV, не обнаружена РНК HCV/ ДНК HBV, недостоверный результат.


Горячая линия (24 часа)
+7(923)590-13-23

667003 Республика Тыва, г. Кызыл, ул.Чехова, д.65

+7(39422)-6-38-47

email: infeksiatuva@mail.ru